Общественный портал

Сотрудники института Крейга Вентера сообщили о новом успехе на пути к созданию искусственных микроорганизмов с заданными свойствами. Используя разработанные ранее методы изготовления синтетических геномов и внедрения их в бактериальные клетки, исследователи создали жизнеспособную бактерию, геном которой содержит всего лишь 531 тысячу пар оснований и 473 гена — меньше, чем у любых существующих в природе микробов, способных к самостоятельному размножению. В ходе работы стало ясно, что современные знания об устройстве клетки и функциях генов всё еще недостаточны для проектирования геномов с чистого листа, поэтому без метода проб и ошибок обойтись пока не удается. Функции 149 из 473 генов «минимального генома» неизвестны: эксперименты показали, что эти гены необходимы для устойчивого роста бактерий, но что именно они делают, еще предстоит выяснить.

Крейг Вентер (John Craig Venter) и сотрудники созданного им института (J. Craig Venter Institute) сделали очередной важный шаг на пути к своей главной цели — созданию искусственных микробов с желаемыми свойствами.

К этой цели Крейг Вентер и его коллеги методично движутся уже более 20 лет, начиная с прочтения в 1995 генома бактерии Mycoplasma genitalium — организма, обладающего самым маленьким геномом из всех живых существ, способных к автономному размножению (внутриклеточные паразиты и облигатные симбионты вроде Nanoarchaeum не в счет, поскольку они пользуются для своего размножения услугами чужой клетки, что потенциально позволяет им уменьшать свой геном хоть до нуля).

У M. genitalium в геноме всего 583 тысячи пар оснований (п. о.) и 525 генов. Однако эта бактерия размножается по микробиологическим меркам очень медленно (удваивает свою численность за 16 часов), и экспериментировать с ней неудобно. Поэтому исследователи используют в качестве основного объекта другую микоплазму, Mycolasma mycoides. Ее геном вдвое больше, зато и размножается она в 16 раз быстрее.

Новое достижение Крейга Вентера и его команды основано на предыдущих революционных прорывах, о которых рассказано в новостях Первая в мире операция по пересадке генома позволила превратить один вид бактерий в другой («Элементы», 02.07.2007) и Создано первое живое существо с синтетическим геномом («Элементы», 25.05.2010). В обсуждаемой работе за основу был взят изготовленный ранее штамм с синтетическим геномом M. mycoides JCVI-syn1.0 (сокращенно syn1.0). Геном этой бактерии содержит 1 078 809 п. о. и почти не отличается от своего природного прототипа — генома диких M. mycoides, за исключением нескольких «водяных знаков» — последовательностей, в которых ученые зашифровали нуклеотидным кодом свои имена и адреса. По мнению Крейга Вентера, такие вставки делать необходимо, чтобы синтетических микробов всегда можно было отличить от натуральных.

Ключевым этапом на пути к проектируемым организмам является выявление минимального набора генов, необходимого для жизни клетки. Речь идет, конечно, о жизни в идеальных лабораторных условиях, но всё-таки о жизни автономной, то есть без помощи других живых клеток. Давно известно, что даже у бактерий с очень маленькими геномами, таких как M. genitalium, в идеальных и неизменных условиях многие гены оказываются избыточными. Следовательно, любой природный геном можно радикально сократить. Решение этой задачи не только даст будущим проектировщикам оптимальную отправную точку, но и позволит лучше разобраться в базовых принципах работы клетки. Именно эту цель и поставили перед собой авторы обсуждаемой статьи.

На первый взгляд задача кажется не такой уж сложной, но это обманчивое впечатление. Очевидный подход к ее решению — сравнить геномы множества разных микробов и найти гены, которые есть у всех без исключения. К сожалению, этот способ не работает: «минимальный набор», который удается выявить с его помощью, состоит примерно из 250 генов и явно недостаточен для жизни клетки. Дело в том, что многие важные функции могут с успехом выполняться разными, непохожими друг на друга генами. Поэтому в геноме каждого микроба есть гены, не являющиеся сверхконсервативными (то есть отсутствующие у многих других микробов), но при этом абсолютно необходимые. Как следствие, чтобы спроектировать минимальный геном, нужно либо в точности знать функцию каждого гена и полный набор необходимых для жизни функций, либо провести огромную экспериментальную работу по определению минимального набора генов методом проб и ошибок.

Сначала авторы попытались пойти первым путем и спроектировать минимальный геном чисто теоретически, понадеявшись, что наука уже накопила достаточно знаний о принципах работы живой клетки и о функциях генов. Расчет был, в частности, на то, что плохо изученные гены не являются жизненно важными.

Исследователи удалили из геномного текста «синтетической бактерии» syn1.0 всё то, что показалось им лишним на основе знаний, накопленных молекулярной биологией. Оставлены были только гены с установленными (и при этом жизненно важными) функциями, а также те, по которым имелись экспериментальные данные, свидетельствующие об их незаменимости.

Спроектированный таким способом «гипотетический минимальный геном» был изготовлен из синтетических олигонуклеотидов, собран воедино и внедрен в клетки микоплазм при помощи методов, описанных в новости Создано первое живое существо с синтетическим геномом («Элементы», 25.05.2010). Но фокус не удался: искусственный геном не смог обеспечить выживание клеток. Разделив его на восемь равных частей и проверив каждую по отдельности (в комбинации с 7/8 исходного генома syn1.0), авторы обнаружили, что только один из восьми фрагментов был спроектирован без фатальных ошибок, да и в нем тоже что-то не так, потому что клетки с этим фрагментом хоть и не погибали, но росли очень медленно.

Неудача заставила авторов пересмотреть своё мнение о степени развития современных биологических знаний и прибегнуть к старому доброму методу проб и ошибок. Раз за разом они синтезировали геномы с теми или иными отредактированными фрагментами, вставляли их в клетки и смотрели, что получится. К счастью, методы, разработанные для изготовления syn1.0 и впоследствии сильно улучшенные, наряду с усовершенствованной методикой транспозонного мутагенеза (см.: Transposon mutagenesis), позволили выполнить эту работу за обозримое время. Авторы сообщают, что сейчас на весь производственный цикл от компьютерного проекта до готового синтетического генома уходит меньше трех недель: почти в 100 раз меньше, чем ушло на создание первого синтетического генома, работа над которым завершилась в 2008 году.

Вместо попыток грубо поделить гены syn1.0 на «необходимые» и «избыточные» авторы разработали более тонкую классификацию, отражающую тот факт, что помимо абсолютно необходимых для жизни генов существует немало таких, без которых на первый взгляд можно обойтись, однако их удаление замедляет рост клеток, а если удалить сразу несколько таких «квази-необходимых» (quasi-essential) генов, клетка может вообще погибнуть.

Восемь восьмушек генома, спроектированные заново с учетом этого обстоятельства, оказались совместимыми с жизнью каждая по отдельности (то есть в комбинации с остальными семью восьмыми исходного генома syn1.0), но все вместе они снова оказались нежизнеспособными. На этот раз причина была в том, что некоторые необходимые функции выполняются двумя взаимозаменимыми генами, расположенными в разных восьмушках. В ходе индивидуальной проверки каждый из этих генов был классифицирован как «избыточный», потому что с его функцией успешно справлялся второй ген. Однако одновременное удаление обоих генов оказалось фатальным. Чтобы вычистить эти ошибки, ученым пришлось долго изучать методом транспозонного мутагенеза промежуточные штаммы, у которых несколько фрагментов генома было отредактировано, а остальные сохранены в исходном виде. Вылавливались гены неотредактированных частей, которые у таких штаммов стали незаменимыми, хотя не были таковыми у syn1.0. В итоге удалось составить список пар генов, из которых можно удалить один, но не оба.

Когда эта и многие другие трудности были наконец преодолены, на свет появился синтетический микроб syn3.0 (название syn2.0 досталось одному из промежуточных результатов работы) — обладатель самого маленького генома из всех клеточных форм жизни, способных к автономному размножению. Его геном — лучшее на сегодняшний день приближение к идеалу «минимального генома» (рис. 2).

Рис. 2. Слева — технология изготовления минимального генома: цикл «Дизайн — Сборка — Тестирование» (Design — Build — Test). Геномные тексты проектируются на компьютере (Design), затем изготавливаются синтетические короткие фрагменты — олигонуклеотиды (Synthesis), из которых при помощи сложного многоступенчатого процесса собирается целый геном (Construction). Этот геном размножается в дрожжевых клетках (Cloning), выделяется в чистом виде (Isolation) и добавляется в культуру клеток Mycoplasma capricolum, некоторые из которых заглатывают эти геномы (Transplantation), а потом делятся, передавая части своих потомков только синтетический геном. Остается проверить, будут ли такие потомки жизнеспособными и оценить скорость их размножения (Outgrowth). Справа — исходный геном syn1.0 (внешнее кольцо) и изготовленный на его основе минимальный геном syn3.0 (внутреннее кольцо). Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Геном syn3.0 существенно меньше, чем у прежнего рекордсмена M. genitalium: он содержит 531 490 п. о., 438 белок-кодирующих генов и 35 генов функциональных РНК. При этом syn3.0 размножается впятеро быстрее, чем M. genitalium (но всё же втрое медленнее, чем syn1.0), удваивая свою численность за три часа. Авторы могли бы убрать еще несколько «квази-необходимых» генов, пожертвовав скоростью роста, но решили этого не делать, чтобы не затруднять себе дальнейшую работу.

Что же представляет собой полученный «минимальный геном»? Из 901 гена syn1.0 была удалена почти половина (428). Среди удаленных преобладают гены белков с неизвестными функциями, гены липопротеинов, мобильные элементы, а также гены, связанные с теми аспектами метаболизма, которые не нужны для жизни в лабораторной питательной среде, содержащей все необходимые бактериям малые молекулы. Например, поскольку в этой среде много глюкозы, большинство генов, связанных с транспортом и метаболизмом других сахаров, удалось безболезненно убрать, оставив только гены, необходимые для поглощения и усвоения глюкозы.

Среди генов, оставшихся у syn3.0, преобладают гены, связанные с сохранением, размножением и считыванием генетической информации (репарация, репликация, транскрипция, трансляция), с клеточным делением, а также гены мембранных белков. Поскольку syn3.0 не способна синтезировать аминокислоты, нуклеотиды, витамины и другие малые молекулы, она должна получать всё это из среды, а для этого нужны транспортные белки, локализованные в клеточной мембране.

Самое интересное, что о функции значительной части генов syn3.0 мало что известно. Для 65 генов из 473 функция неизвестна совсем, а для 84 о ней можно только смутно догадываться по сходству аминокислотных последовательностей с изученными белками других организмов. У многих из этих загадочных генов есть родственники (тоже с неизвестной функцией) в геномах других организмов — от архей до Homo sapiens. По-видимому, они действительно выполняют в клетке какие-то очень важные, но пока не расшифрованные функции. Это показывает, насколько неполны наши знания об устройстве живой клетки.

Внешний вид новых микробов тоже преподнес сюрпризы (рис. 3). В жидкой среде бактерии syn3.0, в отличие от syn1.0, не плавают поодиночке, а оседают на дно, где образуют биопленки с разнообразными структурами, то выстраиваясь аккуратными рядами, то раздуваясь или сливаясь в крупные пузыри. Кроме того, в скоплениях syn3.0 помимо клеток обычного размера (0,5–1,0 мкм) присутствует много мелочи, причем, по-видимому, жизнеспособной (живые клетки, способные образовывать новые колонии, проходят через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм). Вероятно, в процессе редактирования генома исследователи удалили какие-то гены, обеспечивающие устойчивость развития, стабилизирующие процесс клеточного деления или структуру мембран, что и привело к росту случайной изменчивости клеток. Авторы сообщают, что похожие фенотипы наблюдались ранее у некоторых микоплазм при выращивании в нестандартных условиях, в которых могли измениться процессы синтеза липидов и свойства мембран.

Рис. 3. Внешний вид колоний syn1.0 и syn3.0. В жидкой среде клетки syn1.0 плавают по отдельности (вверху слева), тогда как syn3.0 оседают на дно (вверху справа), где образуют биопленки с нитчатыми многоклеточными структурами (белые стрелки) и непонятными крупными пузырями (черные стрелки). Для клеток syn3.0 также характерен большой диапазон изменчивости по размеру (внизу). Длины масштабных отрезков: 10 мкм (верхние фотографии) и 1 мкм (нижние фотографии). Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Крейг Вентер и его коллеги напоследок еще поэкспериментировали с геномом syn3.0, переставляя гены с места на место (многие гены удалось сгруппировать по функциям, что должно облегчить работу будущим дизайнерам), заменяя в генах кодоны на синонимичные и внося однонуклеотидные замены в жизненно необходимые гены рибосомных РНК. Всё это не повлияло на жизнеспособность искусственного микроба, который, следовательно, сохранил какой-то уровень генетической пластичности и может быть подвергнут дополнительной оптимизации.

Данная работа знаменует собой важный рубеж в развитии биотехнологий. Если первая бактерия с синтетическим геномом, syn1.0, по сути мало отличалась от природной бактерии Mycoplasma mycoides, возбудителя пневмонии коров, то про нового микроба syn3.0 этого уже не скажешь. От наследственной информации M. mycoides осталась только половина, гены переставлены, кодоны изменены, фенотип клеток тоже изменился. Пожалуй, можно сказать, что syn3.0 — это не только обладатель самого маленького генома из всех самостоятельно размножающихся живых существ, но и организм, подвергшийся наиболее радикальной искусственной генетической модификации. К тому же его геном был изначально собран из химически синтезированных олигонулеотидов на основе компьютерного проекта. Разработанная авторами мощная система DBT (Design — Build — Test, рис. 2) использовалась в данном случае для изготовления микроба с минимальным геномом, но ведь ее можно с тем же успехом применять для оптимизации бактерий по многим другим (потенциально — чуть ли не по любым) параметрам. Похоже, человечество действительно стоит на пороге эры целенаправленного проектирования живых существ с желаемыми свойствами.

Источник: Clyde A. Hutchison III, Ray-Yuan Chuang, Vladimir N. Noskov, Nacyra Assad-Garcia, Thomas J. Deerinck, Mark H. Ellisman, John Gill, Krishna Kannan, Bogumil J. Karas, Li Ma, James F. Pelletier, Zhi-Qing Qi, R. Alexander Richter, Elizabeth A. Strychalski, Lijie Sun, Yo Suzuki, Billyana Tsvetanova, Kim S. Wise, Hamilton O. Smith, John I. Glass, Chuck Merryman, Daniel G. Gibson, J. Craig Venter. Design and synthesis of a minimal bacterial genome // Science. 2016. V. 351. DOI: 10.1126/science.aad6253.

См. также:
1) Первая в мире операция по пересадке генома позволила превратить один вид бактерий в другой, «Элементы», 02.07.2007.
2) Создано первое живое существо с синтетическим геномом, «Элементы», 25.05.2010.
3) Synthetic microbe has fewest genes, but many mysteries — популярный синопсис к обсуждаемой статье.

Александр Марков