Общественный портал

С пoмoщью флуoрeсцeнтнoгo мaркeрa, скoнструирoвaннoгo нa oснoвe рeгулятoрнoй oблaсти гeнa crestin рыбoк дaниo-рeриo, группa учeныx из СШA, Швeйцaрии и Гeрмaнии прoслeдилa сaмыe рaнниe стaдии зaрoждeния и рaзвития мeлaнoмы. Из мнoжeствa клeтoк, нeсущиx oнкoгeнныe мутaции, тoлькo нeкoтoрыe мoгут дaть нaчaлo рaкoвoй oпуxoли. Тaк, гeнoмы мeлaнoцитoв мнoгиx дoбрoкaчeствeнныx рoдинoк или бoрoдaвoк (нeвусoв) имeют oнкoгeнную мутaцию BRAFV600E, нo эти нeвусы oчeнь рeдкo прeврaщaются в мeлaнoмы. Oкaзaлoсь, чтo при вoзникнoвeнии злoкaчeствeннoй oпуxoли oтдeльныe мeлaнoциты пeрeпрoгрaммируются в сoстoяниe свoиx рaнниx эмбриoнaльныx прeдшeствeнникoв. Удaлoсь тaкжe oпрeдeлить трaнскрипциoнныe фaктoры и пeрeстрoйки xрoмaтинa, связанные с превращением предрасположенных к раку доброкачественных клеток в злокачественные.

Генетический аппарат клеток обладает сложной системой регуляции деления, роста, дифференцировки и физиологической гибели клеток. Нормальное протекание этих процессов, в том числе предотвращение неконтролируемого роста клеток и формирования раковых опухолей, регулируется главным образом двумя типами генов с противоположно направленными функциями — протоонкогенами, стимулирующими рост клеток, и антионкогенами (генами-супрессорами опухолей), сдерживающими избыточный рост (подробнее об онкогенах и антионкогенах см. в новости На пути к детальному каталогу раковых генов, «Элементы», 06.04.2015). Известно, что причиной возникновения раковых клеток и опухолей в общем и меланомы в частности являются мутации, активирующие протоонкогены и/или инактивирующие гены-супрессоры опухолей. Эти ключевые события онкогенеза (см. генетические аспекты канцерогенеза) уже достаточно хорошо изучены. Но в процессе онкогенеза происходят и другие молекулярные события и участвуют механизмы, перепрограммирующие нормальные клетки в раковые. Они остаются еще недостаточно исследованными.

Меланома — одна из очень агрессивных раковых опухолей — образуется в результате злокачественного перерождения меланоцитов, клеток кожи, продуцирующих пигмент меланин. Для изучения самых ранних событий, происходящих при образовании меланомы, авторы обсуждаемой работы провели эксперименты на рыбках данио-рерио (Danio rerio). Эти рыбки наряду с мышами являются излюбленным модельным объектом в исследованиях по эмбриологии и молекулярной биологии позвоночных.

В лаборатории ранее были получены трансгенные данио, несущие мутантный активированный протоонкоген человека BRAFV600E, который часто обнаруживается в опухолях больных меланомой. Экспрессия BRAFV600E контролировалась промотором mitfa, который работает только в меланоцитах. Если в геноме рыбки также отсутствовал активный антионкоген р53 (подробнее о нем см. в новости На пути к детальному каталогу раковых генов, «Элементы», 06.04.2015), на ее теле возникали родинки и бородавки (невусы) и через несколько месяцев развивались меланомы. Но несмотря на наличие многих невусов, меланома развивалась только в некоторых из этих «ракоопасных» участков. Поэтому авторы предположили, что для формирования меланомы важную роль играют еще какие-то молекулярные события, и занялись их изучением.

Ранее с помощью гибридизации in situ было показано, что в меланомах опять начинает экспрессироваться эмбриональный ген рыбок данио-рерио crestin, что зрелому организму не свойственно. Функции этого гена и его продукта пока неясны, но известно, что в процессе эмбриогенеза его продукт маркирует клетки-предшественники нервного гребня (neural crest progenitors, NCP), из которого развиваются меланоциты, и исчезает через 72 часа после оплодотворения. Эти данные побудили исследователей сконструировать ген-репортер на основе регуляторных элементов гена crestin и использовать его для исследования самых ранних этапов формирования меланомы. Они выделили регуляторные элементы этого гена в составе довольно большого фрагмента ДНК (4,5 тыс. пар нуклеотидов, п.н.), соединили его с геном усиленного зеленого флуоресцентного белка (enhanced green fluorescent protein, EGFP) и ввели эту конструкцию в геном данио с помощью методов генетической инженерии (рис. 2).

Рис. 2. Локус crestin и сконструированные на основе его регуляторных элементов флуоресцентные репортеры. Вверху — локус crestin (прототип). Показана локализация LTR-подобной последовательности нуклеотидов, U3-промотороподобной последовательности и последовательности гена crestin, кодирующей белок. ORF (Open reading frame) — открытая рамка считывания, LTR (Long terminal repeat) — длинный концевой повтор. Ниже — фрагменты длиной 4,5 тыс. п.н. и 1 тыс. п.н., использованные для конструирования репортеров — рекомбинантных промоторов гена crestin:EGFP. Белый фрагмент со стрелкой — минимальный промотор гена β-глобина (см. Beta globin). Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

Было показано, что экспрессия EGFP с этого искусственного элемента точно воспроизводит экспрессию гена crestin в эмбриогенезе данио-рерио и специфически маркирует стволовые клетки и клетки-предшественники при формировании нервного гребня зародыша и меланоцитов. Введение такого репортера позволило визуально фиксировать у данио зарождение и развитие меланом (данио-рерио на первых этапах развития полностью прозрачны для видимого света, и это делает их удобным модельным организмом для исследований с использованием флуоресцентных меток). Удалось наблюдать единичные флуоресцирующие клетки задолго до формирования из них морфологически оформленных опухолей (рис. 1). При трансплантации чешуек с такими единичными флуоресцирующими клетками в другие участки тела данио из них развивались меланомы, прораставшие в гиподерму (самый нижний слой кожи). Следовательно, такие единичные клетки уже были инициаторами опухолей.

Рекомбинантный репортер (промотор гена crestin:EGFP) позволил подробно изучить молекулярные механизмы превращения потенциально онкогенных клеток в злокачественные. Сначала авторы выделили минимальный участок ДНК, несущий все регуляторные элементы гена crestin из клонированного ранее фрагмента длиной 4,5 тыс. п.н. Отсекая лишнее, его удалось уменьшить сначала до 1 тыс. п.н. (рис. 1), а затем до 296 п.н. (рис. 3). Биоинформатический анализ структуры этого участка длиной 296 п.н. обнаружил в нем последовательности нуклеотидов, которые являются участками связывания (Binding site) факторов транскрипции. В эти участки гена-репортера вводили инактивирующие мутации и наблюдали экспрессию EGFP под контролем мутантных участков при развитии зародыша данио.

Серия экспериментов позволила установить степень важности различных сайтов связывания и, соответственно, транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию гена crestin в эмбриогенезе. Так, дефект сайта связывания pax3 на экспрессию гена crestin практически не влиял, а дефекты сайтов sox10, tfap2 и E-box ее сильно подавляли (рис. 3). Эти результаты свидетельствуют о том, что экспрессия репортера регулируется факторами транскрипции, свойственными развитию нервного гребня.

Рис. 3. Мутации в участках узнавания для факторов регуляции транскрипции sox10, tfap2 и E-box/myc (mitf), связанных с эмбриогенезом нервного гребешка, существенно снижают уровень специфической экспрессии репортера (промотора гена crestin:EGFP) длиной 296 п.н. в эмбрионах через 24 часа после оплодотворения. Мутации в гипотетическом сайте pax3 на нее практически не влияют. В экспериментах по трансплантации использовалось по 80 или более эмбрионов. Совместная инъекция с репортером ubi:mCh проводилась как контроль успешной трансплантации. Справа показана доля эмбрионов с указанным типом экспрессии репортера crestin:EGFP длиной 296 п.н. Ectopic — неспецифическая экспрессия. Neural Crest — специфическая экспрессия в нервном гребешке. NC+ect — смешанная экспрессия. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

Анализ спектра и уровня экспрессии большого набора генов в ранних ЕGFP+-участках с помощью гибридизации на чипах с подтверждением количественной ПЦР с обратной транскрипцией показал, что при зарождении меланомы возрождаются молекулярные события и профиль экспрессии генов, свойственные предшественникам нервного гребня (NCP). Искусственное усиление экспрессии гена sox10 в меланоцитах экспериментальных данио резко ускоряло возникновение и развитие меланом, а ее подавление замедляло эти процессы.

Была также изучена регуляция экспрессии генов нервного гребня зародыша на эпигенетическом уровне (то есть вызванная механизмами, не затрагивающими последовательности ДНК; в данном случае — модификацией хроматина) и сопоставлена с таковой в зарождающейся меланоме. Участки хроматина с высоким содержанием гистона H3 (Histone H3), ацетилированного по положению K27 (H3K27Ac) (см. модификации гистонов, Modifications to histones), известны как суперэнхансеры (Super-enhancer, SE). Они связываются с ключевыми факторами транскрипции, которые регулируют экспрессию генов, специфичных для данного типа клеток или для раковых клеток.

Для характеристики суперэнхансеров применили методику иммунопреципитации фрагментов хроматина с антителами к Н3К27Ас и с последующим качественным и количественным определением нуклеотидной посдедовательности ДНК в преципитированных фрагментах. Для анализа профиля генов, открытых для усиленной экспрессии, применили также метод ATAC-секвенирования (ATAC-seq). Результаты, полученные с помощью обоих подходов, показали сходство набора активно экспрессирующихся генов на ранних стадиях развития меланомы и при формировании нервного гребня (рис. 4).

Рис. 4. Общая модель инициации меланомы в результате «возвращения» меланоцитов в состояние предшественников нервного гребня (NCP) как следствия активации супер-энхансеров (Super-enhancer, SE). В нормальной ткани происходят генетические события, приводящие к активации онкогенов (BRAFV600E) и инактивации супрессоров опухолей (р53–/–). В результате преодолевается «барьер нормальности» и возникают «ракоопасные» области. В этих областях отдельные клетки преодолевают еще один барьер — возвращаются в состояние предшественников нервного гребня (NCP) и инициируют формирование меланомы. Подавление процесса возвращения медикаментозными или иными средствами может блокировать инициацию меланомы. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

Таким образом, показано, что, кроме мутаций протоонкогенов и антионкогенов, дополнительным важным событием для инициации меланомы является возвращение клеток меланоцитов в состояние их эмбриональных предшественников (рис. 5).

Рис. 5. Перепрограммирование меланоцитов приводит к злокачественной трансформации клеток. В процессе эмбрионального развития рыбки данио в предшественниках нервного гребня (NCP) происходит экспрессия гена crestin (обозначен зеленым цветом), которая регулируется специальным набором факторов транскрипции. Затем NCP мигрируют и превращаются в меланоциты (серые), в которых экспрессия гена crestin прекращается. В модельных данио BRAFV600E/р53–/–-меланоциты экспрессируют онкоген, но лишь немногие из них опять начинают экспрессировать crestin и дают начало инвазивной меланоме. Это происходит в результате случайного обратного перепрограммирования, в ходе которого из-за активации суперэнхансеров ряда ключевых генов эмбриогенеза меланоциты, несущие онкогены, «возвращаются» в состояние, подобное NCP. Рисунок из синопсиса к обсуждаемой статье в Science

Возможно, подобные события происходят при развитии многих раков. Описанное перепрограммирование в принципе открывает новые возможности для диагностики рака и для поиска новых мишеней противораковой терапии — с целью блокирования этого процесса. Но ряд важных вопросов остается пока нерешенным. Например, какое значение для инициации опухоли имеет формирование ее специфического микроокружения («ниши») и как оно происходит? Также важно с помощью описанного флуоресцентного маркера проследить, как меланома превращается в инвазивную опухоль, какие дополнительные факторы транскрипции, эпигенетические регуляторы и сигнальные пути могут быть необходимы для инициации и прогрессии опухоли. Следует также отметить, что аналоги гена crestin данио-рерио ни у мышей, ни у человека пока не найдены. Обнаружение таких маркеров эмбриогенеза позволило бы детально изучить ранние стадии формирования раковых опухолей у человека.

Источники:

1) Charles K. Kaufman, Christian Mosimann, Zi Peng Fan, Song Yang, Andrew J. Thomas, Julien Ablain, Justin L. Tan, Rachel D. Fogley, Ellen van Rooijen, Elliott J. Hagedorn, Christie Ciarlo, Richard M. White, Dominick A. Matos, Ann-Christin Puller, Cristina Santoriello, Eric C. Liao, Richard A. Young, Leonard I. Zon. A zebrafish melanoma model reveals emergence of neural crest identity during melanoma initiation // Science. 2016. DOI: 10.1126/science.aad2197.

2) Soufiane Boumahdi, Cedric Blanpain. Tracking the origins of tumorigenesis // Science. 2016. V. 51. P. 453–454. (Популярный синопсис к обсуждаемой статье в Science.)

Вячеслав Калинин